結(jié)果和討論

界面水的光譜響應(yīng)。圖2顯示了在2100-3100 cm-1范圍內(nèi)，隨著亞相DNA濃度的增加，DPTAP、diC14氨基和DPPC單分子膜的VSF光譜。對(duì)這些數(shù)據(jù)的粗略檢查顯示出幾個(gè)特征。聚焦于圖2面板A，從低頻向高頻移動(dòng)，很明顯，有一個(gè)巨大的雙峰結(jié)構(gòu)，隨著DNA的加入，其振幅突然降低（透明的紅色矩形）；一個(gè)小的、更高頻率的峰值（以≈2675 cm-1），隨著DNA（透明綠色矩形）的加入而增加；在2800-2950 cm-1的頻率范圍內(nèi)有幾個(gè)較窄的峰值（這些峰值是CH拉伸振動(dòng)的結(jié)果，顯示在一個(gè)透明的藍(lán)色矩形中，下面將進(jìn)一步討論）。

圖2。VSF光譜是OD拉伸區(qū)2100-2700 cm-1和CH拉伸區(qū)2850-2975 cm-1的DNA濃度的函數(shù)。陽(yáng)離子脂質(zhì)單分子膜的脂質(zhì)密度為52?2/分子，兩性離子脂質(zhì)單分子膜的脂質(zhì)密度為47?2/分子。A組為DPTAP單層下的VSF光譜，B組為diC14氨基單層下的VSF光譜，C組為DPPC單層下的VSF光譜，D組為含有額外50 mM CaCl2的DPPC單層下的VSF光譜。所有實(shí)驗(yàn)中的亞相都是磷酸鹽緩沖的。每個(gè)面板中的單個(gè)光譜是具有不同濃度λ-DNA噬菌體的相同系統(tǒng)。每個(gè)面板中都顯示了該頻率窗口的磷酸鹽緩沖D2O光譜，以供比較。實(shí)體曲線使用公式1擬合數(shù)據(jù)。

在沈氏集團(tuán)38-40的開(kāi)創(chuàng)性努力之后，20年的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算工作已經(jīng)闡明，大型雙峰結(jié)構(gòu)是界面氫鍵水的OD延伸（見(jiàn)里士滿、戈帕拉克里希南等人、奧斯特羅霍夫和沈和艾倫等人的評(píng)論，以及其中的參考文獻(xiàn)53-56）。最近，我們已經(jīng)證明，這兩個(gè)峰并不是由界面水的兩種不同結(jié)構(gòu)類型造成的：它們是一個(gè)單峰，由于OD拉伸的費(fèi)米共振和D2O彎曲的0 f 2躍遷而明顯傾斜。57-59下面將進(jìn)一步討論，這種費(fèi)米共振可以“關(guān)閉”，通過(guò)探測(cè)界面HOD中的OH或OD拉伸模式，產(chǎn)生的光譜只有一個(gè)峰值。有了這樣的HOD光譜，界面水結(jié)構(gòu)的半定量解釋成為可能，即具有不同狀態(tài)的連續(xù)統(tǒng)。

移動(dòng)到更高的頻率，在2675厘米-1處有一個(gè)小峰值。在沒(méi)有DNA的情況下，該峰值不會(huì)出現(xiàn)在水/脂質(zhì)界面上，并且在該頻率窗口中沒(méi)有出現(xiàn)已知的DNA共振。之前關(guān)于空氣/水界面（水相可能含有酸、堿或鹽）界面水OD（OH）延伸的許多研究表明，在較低頻率下具有雙峰特征，在較高頻率（2735 cm-1）下具有更窄的峰。53,54,56,60,61基于真空中孤立水分子的OD拉伸模式和高水平計(jì)算，很明顯，以2735 cm-1為中心的峰值是自由OD：一種D2O分子，橫跨空氣/水界面，其方式使一個(gè)OD粘附在氣相中（參見(jiàn)圖2中的空氣/水光譜）。由于我們觀察到的峰值頻率均低于自由OD，且僅出現(xiàn)在DNA存在的情況下，因此最容易通過(guò)水直接但微弱地氫鍵連接到DNA或DNA吸附來(lái)解釋它，從而產(chǎn)生一種在沒(méi)有水的情況下不存在的結(jié)構(gòu)類型的水（例如，疏水袋）。下面將進(jìn)一步討論此任務(wù)的限制。

通過(guò)考慮從圖2中的數(shù)據(jù)中提取的強(qiáng)度（即（An/n）2），我們可以更容易地討論這些光譜特征。對(duì)于低頻、大OD峰值（圖2A中透明紅色矩形內(nèi)的光譜特征）的這種方法的結(jié)果如圖3所示（對(duì)于所有系統(tǒng)，OD強(qiáng)度在沒(méi)有DNA的情況下由信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化）。這些結(jié)果量化了我們?cè)趫D2中的定性印象：將DNA的體積濃度從0增加到40 pM，會(huì)導(dǎo)致吸附在陽(yáng)離子脂質(zhì)DPTAP或diC14氨基上的DNA的OD強(qiáng)度損失超過(guò)80%。在兩性離子脂質(zhì)DPPC下面增加DNA濃度，導(dǎo)致OD強(qiáng)度從0降低到80 pM DNA，但總損失僅為初始值的20%。最后，在我們的第四個(gè)系統(tǒng)中，在50 mM CaCl2存在的情況下，增加DPPC單層下的DNA濃度會(huì)產(chǎn)生介于這兩個(gè)極端之間的光譜響應(yīng)：隨著DNA濃度的增加，低頻OD拉伸峰的強(qiáng)度降低≈70%.山頂≈2675 cm-1僅適用于DNA吸附到DPTAP和雙氰胺上的系統(tǒng)（見(jiàn)圖2A，B）。如果我們使用公式1來(lái)量化該峰值的強(qiáng)度，我們將得到圖4所示的結(jié)果。對(duì)于這兩種脂質(zhì)，其趨勢(shì)是相同的：強(qiáng)度迅速增加，飽和于≈40μm的DNA體積濃度，此后振幅略有下降。當(dāng)我們?cè)谙旅孢M(jìn)一步討論這個(gè)峰的詳細(xì)分配時(shí)，我們注意到DNA鏈中的OH基團(tuán)只存在于鏈的末端：對(duì)于每個(gè)DNA鏈，只有兩個(gè)末端OH基團(tuán)。由此產(chǎn)生的DNA OH基團(tuán)的密度為每小時(shí)1個(gè)≈15000 nm2；足夠小，以至于DNA OH基團(tuán)的密度太低，無(wú)法引起任何觀察到的光譜變化。

圖3。根據(jù)圖2中的數(shù)據(jù)擬合氫鍵OD拉伸強(qiáng)度（即（An/n）2）。氫鍵OD拉伸峰在圖2A中的透明紅色矩形中突出顯示。這些結(jié)果清楚地表明，雖然所有脂質(zhì)單分子膜下的OD強(qiáng)度隨著DNA濃度的增加而降低，但帶電脂質(zhì)下的變化要大得多。

圖4。圖2面板A和B中所示光譜的“弱”O(jiān)D拉伸峰的擬合光譜強(qiáng)度。這些結(jié)果清楚地表明，上述“弱”O(jiān)D拉伸峰的強(qiáng)度穩(wěn)定≈30 pM的DNA體積濃度。

原則上，我們數(shù)據(jù)中的每一個(gè)振動(dòng)模式都包含三個(gè)可觀測(cè)值：光譜振幅、線型和基礎(chǔ)模式的中心頻率。圖3和圖4所示的強(qiáng)度受前兩個(gè)因素的影響，基本上我們觀察的是總的積分光譜強(qiáng)度，但不涉及第三個(gè)因素。對(duì)于DNA/DPPC和DNA/DPPC/Ca2+系統(tǒng)，圖2面板C和D的檢查表明，這種從光譜中提取信息的方式是合理的：中心頻率沒(méi)有明顯的變化。對(duì)于DNA/DPTAP和DNA/diC14氨基系統(tǒng)，情況更為復(fù)雜。例如，對(duì)于DNA/DPTAP系統(tǒng)，很明顯～相對(duì)于主峰，強(qiáng)度增加2500 cm-1～2400 cm-1，隨著DNA濃度的增加。下面將更詳細(xì)地討論基本模式的這種明顯的頻率偏移是否對(duì)應(yīng)于實(shí)際的頻率偏移。

因此，我們對(duì)這些系統(tǒng)的OD拉伸頻率區(qū)域有三個(gè)主要觀察結(jié)果。（i）隨著DNA的加入，低頻峰的積分光譜強(qiáng)度降低。光譜響應(yīng)的強(qiáng)度與靜電相關(guān)：陽(yáng)離子脂質(zhì)單分子膜下的界面水比兩性離子單分子膜下的界面水對(duì)多陰離子DNA的吸附更敏感。在Ca2+存在下，兩性離子單分子膜下方的水（被認(rèn)為使兩性離子單分子膜名義上具有陽(yáng)離子16）具有中等靈敏度。（ii）在陽(yáng)離子單分子膜下，這種OD拉伸模式的中心頻率可能會(huì)隨著DNA的加入而移動(dòng)（因?yàn)樗鼤?huì)降低振幅）；在兩性離子單分子膜下，它不會(huì)。（iii）OD拉伸峰出現(xiàn)在更高的頻率，2675 cm-1，僅在陽(yáng)離子單分子膜下方存在DNA的情況下。為了理解這些觀察對(duì)于分子結(jié)構(gòu)的意義，我們需要更詳細(xì)地考慮能夠影響VSF光譜響應(yīng)的因素。

隨著DNA濃度的增加，有五個(gè)因素可能會(huì)導(dǎo)致OD拉伸光譜響應(yīng)的變化。（i）由于脂質(zhì)與聚陰離子DNA的相互作用，DC界面場(chǎng)可能會(huì)發(fā)生變化（其中初始場(chǎng)是帶電脂質(zhì)頭基（DPTAP和diC14氨基）和兩性離子頭基（DPPC）偶極子的結(jié)果，伴隨DNA吸附的場(chǎng)變化預(yù)計(jì)只會(huì)調(diào)制光譜振幅）。（ii）新結(jié)構(gòu)類型的水（與新受體或供體氫鍵的水）的產(chǎn)生，預(yù)計(jì)會(huì)改變OD拉伸中心頻率和線型，并且其他類型界面水的密度保持不變，導(dǎo)致光譜振幅增加。（iii）被吸附的DNA可以置換界面水，導(dǎo)致界面水分子數(shù)量減少（如果DNA置換所有“類型”的水的程度相同，這種置換只會(huì)導(dǎo)致光譜振幅降低）。（iv）DNA的吸附可能會(huì)產(chǎn)生額外的非中心對(duì)稱區(qū)域（即，脂質(zhì)-水界面可能會(huì)改變?yōu)橹|(zhì)-水-DNA-水界面）。如果吸附在DNA螺旋另一側(cè)的水分子發(fā)生破壞性干擾，這將導(dǎo)致光譜振幅降低。（v）吸附的DNA可能會(huì)導(dǎo)致界面水分子重新定向，從而使它們的OD拉伸振幅（在我們的實(shí)驗(yàn)幾何中很明顯）顯著降低。

效應(yīng)（iv）表明，DNA的吸附產(chǎn)生了大量新的界面水。對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的檢查表明，這種水很可能是氫鍵結(jié)合在雙螺旋外部的磷酸鹽上。然而，對(duì)水合雙層膜進(jìn)行的大量紅外和模擬研究表明，磷酸鹽是比大量水更好的氫鍵受體：吸附到DNA上的VSF活性水的增加應(yīng)導(dǎo)致OD拉伸帶中心頻率的紅移。62,63當(dāng)我們看到含有陽(yáng)離子脂質(zhì)的系統(tǒng)的該頻帶向更高頻率轉(zhuǎn)移，而含有DPPC的系統(tǒng)的該頻帶沒(méi)有轉(zhuǎn)移時(shí)，這種效應(yīng)似乎不太可能起到顯著作用，因此不再進(jìn)一步討論。界面水VSF光譜響應(yīng)的偏振分析表明，我們看到的氫鍵OD拉伸強(qiáng)度的振幅降低（圖2面板A中的紅色特征）將需要水分子重新定向超過(guò)60°（相對(duì)于表面法線）。60據(jù)我們所知，沒(méi)有對(duì)于這種或任何其他水性界面，存在這樣的極端重新取向的獨(dú)立證據(jù)，我們也沒(méi)有進(jìn)一步考慮效應(yīng)（V）。在下文中，我們更詳細(xì)地考慮效應(yīng)（I）-（III）。

許多以前的工作已經(jīng)證明，由于界面液體分子定向力較弱的表面場(chǎng)減小，或由于（3）對(duì)和頻信號(hào)的貢獻(xiàn)減小，或兩者兼而有之，和頻強(qiáng)度隨著表面電位的降低而降低。64-66 McLoughlin等人已經(jīng)證明，DNA吸附到陽(yáng)離子脂質(zhì)DODAB（二十八烷基二甲基溴化銨）上會(huì)導(dǎo)致≈0.3 V，而在Ca2+存在下，兩性離子脂質(zhì)DSPC（二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿）對(duì)DNA的吸附（未測(cè)量裸DSPC單層在DNA存在下的表面電位變化）導(dǎo)致表面電位降低小于0.1 V。如果我們假設(shè)DPTAP和雙氰胺表現(xiàn)類似對(duì)于DODAB和DPPC，與DSPC類似，光譜響應(yīng)隨DNA吸附的變化似乎定性地映射到電位降低：DNA吸附到陽(yáng)離子脂質(zhì)上導(dǎo)致比吸附到兩性離子上更大的表面電位降低，前者顯示氫鍵OH拉伸強(qiáng)度比后者更大的降低。

這些表面電位和OD拉伸強(qiáng)度的定性趨勢(shì)也與之前的許多X射線、模擬和熱力學(xué)工作一致。已知DNA對(duì)含有陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂質(zhì)單層或雙層具有相對(duì)較強(qiáng)的吸附（伴隨著相對(duì)較大的表面電位變化），并具有相對(duì)較高的最大吸附密度。對(duì)于含有陽(yáng)離子單分子膜的系統(tǒng)，我們看到界面水對(duì)DNA存在的最強(qiáng)光譜響應(yīng)。另一方面，已知DNA對(duì)僅含有兩性離子脂質(zhì)的單層或雙層吸附較弱（如果有的話）；19,21,31,33,67在兩性離子脂質(zhì)DPPC下面，我們看到界面水對(duì)DNA濃度增加的微弱光譜響應(yīng)。最后，已知含有兩性離子脂質(zhì)和二價(jià)或更高價(jià)小陽(yáng)離子的系統(tǒng)既有DNA的中間吸附能，中間最大吸附密度，也有吸附表面電位的中間變化。17-19,31,67對(duì)于我們使用DPPC/Ca2+和增加DNA濃度的實(shí)驗(yàn)，界面水的光譜響應(yīng)顯然是中間的。

因此，表面電位的降低似乎定性地解釋了吸附在脂質(zhì)單層上的DNA的VSF水信號(hào)的減少。我們之前使用簡(jiǎn)單的表面絡(luò)合+Gouy-Chapman（SCGC）模型，通過(guò)調(diào)節(jié)陽(yáng)離子脂質(zhì)的界面場(chǎng)，對(duì)導(dǎo)致VSF光譜振幅降低的DNA吸附進(jìn)行了定量描述。48該模型的邏輯（我們采用的特定公式僅適用于DNA吸附到陽(yáng)離子脂質(zhì)的情況）是，增加DNA的體積濃度對(duì)陽(yáng)離子單層下方VSF OD拉伸強(qiáng)度的影響是減少有效表面電荷，從而降低表面電位（古伊-查普曼方程無(wú)法量化）?？紤]到這種方法沒(méi)有明確解釋DNA吸附自由能的熵貢獻(xiàn)，也沒(méi)有考慮到隨著DNA體積濃度的變化，界面水結(jié)構(gòu)的變化，這種方法的效果出人意料地好。

為了使SCGC模型適用，界面水結(jié)構(gòu)不能隨界面DNA濃度的變化而變化。如果發(fā)生任何此類變化，我們預(yù)計(jì)它們會(huì)導(dǎo)致界面水OD延伸的中心頻率發(fā)生偏移。與本文報(bào)道的實(shí)驗(yàn)類似，將NaCl添加到DPTAP單層下方的水相中，48并將各種離子添加到CaF2 68和Alumina69下方的水相中，表明界面水鍵拉伸的中心頻率沒(méi)有變化：添加離子似乎只會(huì)減弱界面D2O（H2O）的OD（OH）拉伸。與這些系統(tǒng)類似，隨著DNA濃度的增加，DPPC和DPPC/Ca2+系統(tǒng)在D2O中OD拉伸的中心頻率沒(méi)有明顯變化（見(jiàn)圖2面板C和D）。因此，觀察到的DPPC和DPPC/Ca2+系統(tǒng)與DNA相互作用時(shí)的水響應(yīng)變化與由于脂質(zhì)與聚陰離子DNA相互作用導(dǎo)致的DC界面場(chǎng)變化一致。

然而，如上所述，DPTAP/DNA（圖2A）或diC14氨基/DNA（圖2B）系統(tǒng)的情況更不透明。對(duì)于這些系統(tǒng)，光譜響應(yīng)明顯發(fā)生顯著變化，但通過(guò)檢查圖2中的數(shù)據(jù)，很難判斷這些變化是否可以純粹由線形或光譜振幅的變化來(lái)解釋。正如我們之前所討論的，由于與分子內(nèi)和可能的分子間耦合相關(guān)的效應(yīng)，在這種情況下提取界面水的中心頻率變化是困難的。57-59這種分子內(nèi)耦合使得很難通過(guò)檢查和將數(shù)據(jù)與等式1中的線形模型進(jìn)行擬合來(lái)確定基礎(chǔ)OD（OH）拉伸模式的中心頻率或?qū)挾仁欠耠SDNA的添加而改變。57,58這個(gè)問(wèn)題是使用VSF光譜研究界面水的一般問(wèn)題。正如我們之前所指出的，并證明了水和二氧化硅/水界面上的幾種不同的脂質(zhì)單層，通過(guò)檢查HOD的OD延伸而不是D2O，可以克服這種復(fù)雜性。59這種方法的結(jié)果，對(duì)于雙14-氨基體系，如圖5所示。從這些HOD數(shù)據(jù)可以明顯看出，HOD共振的中心頻率向更高的頻率偏移了≈80 cm-1，隨著DNA體積濃度的增加。

圖5。HOD在H2O中OD拉伸頻率窗口的光譜，給出了在diC14氨基單層下含有增加濃度DNA的磷酸鹽緩沖亞相。HOD的OD拉伸光譜只有一個(gè)單峰結(jié)構(gòu)，并且清楚地表明，隨著DNA濃度的增加，共振振幅降低，共振向更高的頻率移動(dòng)。

觀察到OD拉伸共振頻率的變化，證明了界面水的結(jié)構(gòu)隨著DNA的吸附而發(fā)生變化。因此，與我們之前的結(jié)論相反，陽(yáng)離子脂質(zhì)的界面水VSF強(qiáng)度的降低不能完全由表面電位的降低來(lái)解釋。48也就是說(shuō)，添加陽(yáng)離子脂質(zhì)的DNA后，界面水明顯重組。隨著DNA濃度的增加，HOD譜向更高頻率移動(dòng)，這表明界面水的平均氫鍵強(qiáng)度降低。例如，在反膠束中所含的欠配位水中，已經(jīng)觀察到平均氫鍵強(qiáng)度弱于水在本體中所經(jīng)歷的氫鍵強(qiáng)度。70,71

因此，我們觀察到，隨著吸附在陽(yáng)離子脂質(zhì)上的DNA濃度的增加，低頻OD拉伸峰（圖2中的透明紅色矩形）移向更高的頻率，而隨著吸附在兩性離子脂質(zhì)上的DNA濃度的增加，這種模式的中心頻率沒(méi)有明顯的變化。我們和其他人之前對(duì)小離子在不同界面上吸附的觀察表明，與兩性離子脂質(zhì)/DNA的情況類似，中心頻率沒(méi)有變化。48,68,69由于單個(gè)帶負(fù)電荷的堿基的分子足跡是有序的，因此脂質(zhì)頭基的大?。ㄏ鄬?duì)于陰離子如Cl-）和DNA鏈的吸附能比小離子的吸附能大得多，聚合物DNA的吸附明顯擾亂了界面水結(jié)構(gòu)，而單體離子的吸附則沒(méi)有，這也許并不奇怪。

要理解為什么吸附在陽(yáng)離子脂質(zhì)單層上的DNA會(huì)改變界面水結(jié)構(gòu)，而吸附在兩性離子脂質(zhì)上的DNA不會(huì)改變界面水結(jié)構(gòu)，則更為微妙。之前的X射線散射和衍射研究已經(jīng)闡明，DNA與陽(yáng)離子脂質(zhì)的結(jié)合是化學(xué)計(jì)量的：對(duì)于雙組分（一種陽(yáng)離子脂質(zhì)、一種兩性離子脂質(zhì)和DNA）脂復(fù)合物，觀察到吸附的DNA量隨著相對(duì)陽(yáng)離子脂質(zhì)濃度的增加而線性增加（在很大范圍內(nèi)），12,13,15,72而對(duì)于單組分陽(yáng)離子脂質(zhì)單層，吸附的DNA密度隨著總脂質(zhì)密度的增加而線性增加。73這些觀察結(jié)果的含義是，人們可能會(huì)寫出一個(gè)化學(xué)上真實(shí)的公式，描述單個(gè)DNA堿基與單個(gè)陽(yáng)離子脂質(zhì)分子的結(jié)合。更定量地說(shuō)，在Mg2+存在下，對(duì)吸附在陽(yáng)離子脂質(zhì)甲基三十八烷基溴化銨和兩性離子脂質(zhì)1,2-二吡啶基磷脂酰乙醇胺單層上的DNA的X射線反射研究表明，在與我們的實(shí)驗(yàn)類似的脂質(zhì)密度下，陽(yáng)離子單層上的鏈間距達(dá)到≈30?而兩性離子單層膜上的是≈42?.17,18,73在二價(jià)陽(yáng)離子Mg2+、Mn2+、Ca2+和Co2+存在下對(duì)DNA和陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂復(fù)合物的研究表明，在臨界離子濃度以上（由于2D離子凝聚），可能會(huì)出現(xiàn)更小的鏈間間隔，但這一現(xiàn)象尚未針對(duì)單層進(jìn)行探索。15最后，與這些實(shí)驗(yàn)研究一致的是，簡(jiǎn)單的熱力學(xué)論證表明，吸附在陽(yáng)離子脂質(zhì)單層上的每個(gè)DNA分子都將平鋪（見(jiàn)Wurpel等人48的支持信息）。總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)先前的工作描繪了DNA以相對(duì)較高的表面覆蓋率吸附到陽(yáng)離子脂質(zhì)上的圖片，其方式與脂質(zhì)環(huán)境有關(guān)，并為小陽(yáng)離子提供了獨(dú)特的界面環(huán)境。鑒于這種界面環(huán)境在DNA、脂質(zhì)和小陽(yáng)離子方面是高度結(jié)構(gòu)化的，我們希望提出一個(gè)問(wèn)題，這個(gè)順序?qū)ψ罱K主要界面化學(xué)物種水的光譜響應(yīng)有什么影響？

由于已知水化脂質(zhì)頭基團(tuán)經(jīng)歷高度非均相氫鍵環(huán)境，58,59,63,74-78我們預(yù)計(jì)DNA對(duì)陽(yáng)離子脂質(zhì)的吸附將以兩種方式影響界面水的光譜響應(yīng)。首先，界面上的水分子數(shù)量減少：DNA取代了水。由于水在脂類附近經(jīng)歷了一個(gè)不均勻的氫鍵環(huán)境，并且由于DNA不可能以同樣的效率置換所有這些類型的界面水，因此這種脫水（正如我們觀察到的）預(yù)計(jì)會(huì)導(dǎo)致潛在模式的中心頻率發(fā)生移移移，同時(shí)振幅降低。第二，由于已知DNA陽(yáng)離子脂質(zhì)復(fù)合物的化學(xué)計(jì)量比，已知陽(yáng)離子脂質(zhì)上的DNA吸附密度高，并且已知吸附的DNA會(huì)創(chuàng)造一種獨(dú)特的離子環(huán)境，因此我們希望看到一種在沒(méi)有DNA的情況下不存在的界面水。

只有當(dāng)DNA吸附到陽(yáng)離子脂質(zhì)上時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)額外的水結(jié)構(gòu)類型，這一預(yù)期表明，只有當(dāng)DNA吸附到陽(yáng)離子脂質(zhì)上時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)OD模式。如前所述，2675 cm-1峰值最容易理解為這種模式。雖然在大量水的紅外測(cè)量中不存在，但在各種不同的系統(tǒng)中都可以看到界面水的多個(gè)分離良好的共振。到目前為止，最常見(jiàn)的例子是出現(xiàn)在空氣/水界面上的自由和氫鍵OD共振（見(jiàn)里士滿、戈帕拉克里希南等人、艾倫等人的評(píng)論，以及其中的參考文獻(xiàn)53,54,56）。在其他系統(tǒng)中，多個(gè)分離良好的界面水共振出現(xiàn)的頻率低于游離OD（OH）的頻率不太常見(jiàn)，但在一些簡(jiǎn)單表面活性劑和磷脂Langmuir單分子膜的VSF研究中已觀察到。61,79同樣，在部分水合Nafion膜和聚合物系統(tǒng)的紅外吸收研究中也觀察到了分裂OH拉伸模式。80,81對(duì)于Langmuir單層和Nafion膜研究，更高頻率模式的起源歸因于存在于相對(duì)疏水微環(huán)境中的水分子。對(duì)于水合聚合物材料，這些峰歸因于與相對(duì)非極性酯氧鍵合的水。81

受之前這項(xiàng)工作的啟發(fā)，似乎很清楚，兩種分子情景，或其組合，可以解釋2675 cm-1峰的出現(xiàn)。首先，我們可以想象水分子相對(duì)獨(dú)立于大量水，與其他水分子相比，水分子向較弱的受體提供氫鍵。第二，幾何因素導(dǎo)致的集體效應(yīng)，限制使某些水分子亞群不可能滿足其全部氫鍵配額。雖然很難確定這兩種情況中的哪一種或某種組合更適合DNA/陽(yáng)離子脂質(zhì)系統(tǒng)，但值得強(qiáng)調(diào)的是，VSF對(duì)磷脂單分子膜下的水的研究，單糖溶劑化的IR研究，部分水合雙層疊層的紅外光譜研究也沒(méi)有顯示出這種分離的水鍵拉伸振動(dòng)。63,75-78,82綜上所述，這些研究表明，在DNA存在的情況下，這種2675 cm-1的出現(xiàn)可以最容易地解釋為一種欠協(xié)調(diào)的承壓水物種的出現(xiàn)，類似于之前提出的在此類系統(tǒng)中的二價(jià)陽(yáng)離子。15注意，我們?cè)贒PTAP上吸附的DNA（具有相對(duì)非極性的酯氧）和diC14-氨基（不具有）上都看到了這種模式，這一事實(shí)澄清了這個(gè)峰值不太可能是水氫鍵與相對(duì)非極性受體的結(jié)果。

雖然已知DNA以化學(xué)計(jì)量的方式吸附到陽(yáng)離子脂質(zhì)單分子膜上，但之前的許多研究表明，吸附到兩性離子脂質(zhì)DPPC上的DNA并非如此。16-19,21在這個(gè)系統(tǒng)中，在沒(méi)有Ca2+或其他多價(jià)離子的情況下，DNA的吸附非常弱，并且在這種離子存在的情況下，不會(huì)以化學(xué)計(jì)量方式吸收：在存在過(guò)量DNA和大量Ca2+的情況下，觀察到被吸附DNA的表面密度與脂質(zhì)密度無(wú)關(guān)。18,31,33這種吸附缺乏特異性被認(rèn)為是單層中相對(duì)較高的Ca2+遷移率的結(jié)果（導(dǎo)致每個(gè)DNA鏈感覺(jué)到一個(gè)平均的鈣吸附場(chǎng)）。在沒(méi)有Ca2+的情況下，DNA對(duì)DPPC的弱吸附及其在該離子存在下的非特異性吸附都與低頻OD拉伸峰在振幅降低時(shí)沒(méi)有移動(dòng)以及2675 cm-1處沒(méi)有峰相一致。這兩種觀察結(jié)果最容易理解為一種結(jié)構(gòu)化的、化學(xué)計(jì)量比的DNA/脂質(zhì)復(fù)合物的結(jié)果，該復(fù)合物也會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)化的、相對(duì)受限的界面水，對(duì)于含有DNA和DPPC的系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，兩者都不存在。

脂質(zhì)尾部CH模式的光譜響應(yīng)。如果我們回到圖2所示的數(shù)據(jù)，很明顯在2800-2950 cm-1區(qū)域（透明的藍(lán)色矩形）也有幾個(gè)峰值。在幾十年的紅外吸收和自發(fā)拉曼測(cè)量的基礎(chǔ)上，利用脂類單層或簡(jiǎn)單表面活性劑的VSF光譜進(jìn)行的先前研究已經(jīng)確定，該光譜區(qū)域包含六種CH拉伸模式：CH2對(duì)稱拉伸、CH3對(duì)稱拉伸、，CH2對(duì)稱拉伸和彎曲泛音的費(fèi)米共振，CH2不對(duì)稱拉伸，CH3不對(duì)稱拉伸和CH3對(duì)稱拉伸和彎曲泛音的費(fèi)米共振。52,74,83-86因?yàn)榻缑婀庾V中這六個(gè)峰的出現(xiàn)是每個(gè)模式的橫截面、VSF設(shè)置的光譜分辨率和單層結(jié)構(gòu)的函數(shù)，在許多系統(tǒng)中，只有一部分是明顯的。圖6顯示了DPTAP和雙14氨基單分子膜（在沒(méi)有DNA的情況下）的情況。

圖6。diC14 amdine在26 mN/m（灰色）下的SFG光譜（點(diǎn)）和DPTAP（黑色）在20 mN/m下的SFG光譜（點(diǎn)）。垂直線表示亞甲基對(duì)稱拉伸（CH2SS）、甲基對(duì)稱拉伸（CH3SS）、亞甲基非對(duì)稱拉伸費(fèi)米共振（CH2FR）、亞甲基非對(duì)稱拉伸（CH2AS）的位置，甲基對(duì)稱拉伸費(fèi)米共振（CH3FR）和甲基不對(duì)稱拉伸（CH3AS）。為清晰起見(jiàn)，DPTAP頻譜偏移。實(shí)體曲線使用洛倫茲模型擬合數(shù)據(jù)。

我們和其他人之前的許多工作已經(jīng)表明，可以使用CH拉伸光譜的變化（例如，作為表面壓力或膽固醇濃度的函數(shù)）作為單層中脂質(zhì)尾部局部有序性的探針。尤其是87-90，我們對(duì)脂質(zhì)尾部順序的度量是CH3模式的強(qiáng)度與CH2模式的強(qiáng)度之比。這樣的比率是一個(gè)有序的探針，因?yàn)樵诘椭芏认?，末端甲基傾向于彼此隨機(jī)定向，因此，平均而言，幾乎不會(huì)產(chǎn)生VSF信號(hào)。相比之下，在高脂密度下，尾巴被認(rèn)為是緊湊的全反式排列。在這種配置中，終端CH3指向相似的方向（從而產(chǎn)生強(qiáng)VSF信號(hào)），而單個(gè)CH2基團(tuán)與其相鄰基團(tuán)具有反轉(zhuǎn)對(duì)稱性（從而減少亞甲基相關(guān)模式中的VSF信號(hào)）。在這里，我們特別感興趣的是DNA吸附對(duì)雙14氨基尾序列的影響。在此之前的工作之后，87-90我們通過(guò)擬合CH拉伸頻率區(qū)域中的原始數(shù)據(jù)，提取相關(guān)CH強(qiáng)度，確定CH3SS/CH2SS的比率，以及測(cè)量雙氰胺單層在存在和不存在DNA的情況下的壓縮等溫線來(lái)解決這一主題。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖7所示。

圖7。（上圖）在不存在（紅線）和存在（藍(lán)線，150μm）DNA的情況下，磷酸緩沖亞相上方的diC14氨基單層的π-面積等溫線。對(duì)于給定的脂質(zhì)密度，將DNA添加到亞相會(huì)導(dǎo)致表面壓力增加，或者相當(dāng)于脂質(zhì)分子的凝聚。（下圖）不同濃度的DNA溶液上的CH2SS和CH3SS共振（三角形和圓形，右軸）的VSF強(qiáng)度及其比率R（正方形，左軸）。實(shí)線是眼睛的向?qū)А?

圖7（上圖）所示的壓縮等溫線清楚地表明，DNA對(duì)diC14氨基單層膜的影響，在很大的密度范圍內(nèi)，是增加表面壓力，或等效地降低表面張力。也就是說(shuō)，加入DNA后，表面生成的自由能總是變得更有利。然而，在沒(méi)有進(jìn)一步信息的情況下，這些實(shí)驗(yàn)幾乎無(wú)法深入了解表面熱力學(xué)變化的分子基礎(chǔ)。雙14-氨基單分子膜的CH區(qū)域的VSF光譜作為DNA濃度的函數(shù)，以及由此產(chǎn)生的CH3SS/CH2 SS比率，提供了這樣的見(jiàn)解。如圖7（下圖）所示，向亞相添加DNA，即使在40 pM以下的體積濃度下，也會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)尾部順序的強(qiáng)烈增加。在解釋電子自旋共振研究的結(jié)果時(shí)，貝納蒂及其同事曾認(rèn)為，吸附的DNA使凝膠相雙氰胺雙層（低于23°C）流態(tài)化，并使液相雙層（高于23°C）僵化，從而有效地平滑了在沒(méi)有DNA的情況下急劇的熱相變。91我們的光學(xué)和壓力等溫線測(cè)量都是在略低于熔融溫度的情況下進(jìn)行的。我們的壓縮等溫線表明，DNA的作用是增加表面上單個(gè)鏈之間的相互作用（降低表面張力），而光學(xué)測(cè)量表明，鏈相互作用的增加導(dǎo)致脂質(zhì)尾部更有序。有趣的是，這些結(jié)果與這樣一種情況是一致的，即DNA的加入似乎會(huì)產(chǎn)生脂質(zhì)，兩者之間的相互作用比沒(méi)有DNA時(shí)更強(qiáng)烈，尾巴比沒(méi)有DNA時(shí)更有序，鏈的流動(dòng)性增強(qiáng)。這種脂鏈流動(dòng)性和脂鏈順序的解耦類似于之前觀察到的膽固醇和DPPC混合物隨溫度變化的情況。92

總結(jié)和結(jié)論

了解脂質(zhì)復(fù)合體中DNA/脂質(zhì)關(guān)聯(lián)的分子水平的詳細(xì)相互作用有可能從根本上改善基因治療。雖然許多研究人員已經(jīng)證明了結(jié)構(gòu)探測(cè)技術(shù)（主要是X射線和中子反射和衍射）對(duì)這些系統(tǒng)的適用性，但光譜研究，尤其是那些直接探測(cè)分子間相互作用的研究，頻率要低得多。缺乏應(yīng)用這些技術(shù)來(lái)研究脂叢形成的部分原因可以理解為，難以應(yīng)用光譜技術(shù)來(lái)描述本質(zhì)上是界面的現(xiàn)象，而光譜技術(shù)是體敏的。在這里，我們通過(guò)應(yīng)用振動(dòng)和頻光譜學(xué)來(lái)研究脂質(zhì)/DNA關(guān)聯(lián)，從而繞過(guò)了這個(gè)問(wèn)題。我們以界面重水分子的OD拉伸為報(bào)告，間接研究了DNA與脂質(zhì)頭基的絡(luò)合，并以陽(yáng)離子脂質(zhì)雙14酰胺尾的CH拉伸模式，直接研究了吸附的DNA對(duì)單層結(jié)構(gòu)的影響。

我們發(fā)現(xiàn)，光譜響應(yīng)中最顯著的差異與靜電學(xué)的變化有關(guān)：陽(yáng)離子脂質(zhì)下界面D2O的OD拉伸的振幅和線型比兩性離子脂質(zhì)DPPC下的OD振幅和線型對(duì)DNA濃度的增加更敏感。對(duì)于DPPC/DNA/Ca2+系統(tǒng)，觀察到一種介于陽(yáng)離子脂質(zhì)/DNA和DPPC/DNA之間的反應(yīng)，這與之前的工作一致，之前的工作提出Ca2+的作用是部分中和DPPC磷酸基團(tuán)，使兩性離子DPPC多少呈陽(yáng)性，從而使脂質(zhì)/DNA結(jié)合。16-19,21

對(duì)這四個(gè)體系中DNA濃度增加時(shí)OD拉伸反應(yīng)的更詳細(xì)研究表明，對(duì)于陽(yáng)離子脂質(zhì)，而不是兩性離子脂質(zhì)，額外的高頻OD峰僅在DNA存在時(shí)出現(xiàn)。這一峰值的存在可以很容易地解釋為由不協(xié)調(diào)的水物種造成的。要使這種物種在VSF光譜中可見(jiàn)，它必須在顯微鏡下有序（即在分子長(zhǎng)度尺度上破壞反轉(zhuǎn)對(duì)稱性）。X射線研究表明，陽(yáng)離子脂質(zhì)/DNA系統(tǒng)具有良好的有序性，且吸附的DNA鏈間距較小。12,13,15,72我們的水質(zhì)結(jié)果與這樣一個(gè)有序的環(huán)境是一致的。與DNA/陽(yáng)離子脂質(zhì)系統(tǒng)的X射線研究相比，DNA/兩性離子脂質(zhì)系統(tǒng)的研究表明，在沒(méi)有二價(jià)陽(yáng)離子的情況下，DNA幾乎沒(méi)有吸附，而在Ca2+存在的情況下，DNA的非特異性吸附具有較低的鏈間順序。16-18因此，這種系統(tǒng)沒(méi)有明顯的2675 cm-1峰值的觀察結(jié)果也與這里的X射線結(jié)果一致。

對(duì)于兩性離子脂質(zhì)，通過(guò)D2O亞相收集的光譜檢查表明，隨著DNA濃度的增加，中心頻率沒(méi)有變化，只是光譜振幅降低。對(duì)于陽(yáng)離子脂質(zhì)下面的OD拉伸，響應(yīng)確實(shí)會(huì)發(fā)生變化，但對(duì)于D2O，這種變化很難量化，部分原因是這種共振具有明顯的雙峰性質(zhì)。我們通過(guò)關(guān)注HOD的OD拉伸光譜隨diC14脒下DNA濃度增加的變化來(lái)克服這個(gè)問(wèn)題。這些結(jié)果表明，隨著DNA的加入，共振的振幅降低，并移向更高的頻率。這一觀察到的藍(lán)移與我們從這些系統(tǒng)2675 cm-1峰的出現(xiàn)中得出的結(jié)論一致：低頻OD拉伸峰揭示了僅在DNA存在的情況下發(fā)生的界面水的結(jié)構(gòu)形式的信息。

最后，我們還通過(guò)測(cè)量存在和不存在DNA時(shí)的壓縮等溫線，以及檢查作為DNA濃度函數(shù)的CH拉伸頻率區(qū)域的演變，研究了DNA吸附改變二氫吡啶脂質(zhì)順序和堆積的方式。π/面積實(shí)驗(yàn)表明，在所有脂質(zhì)密度中，DNA的存在導(dǎo)致脂質(zhì)單層的表面張力降低。CH頻率范圍的光譜顯示，添加DNA的效果是使脂質(zhì)尾部有序（在有DNA的情況下，平均而言，雙14-氨基尾部比沒(méi)有DNA的情況下更接近全反式構(gòu)象）。這一結(jié)構(gòu)信息補(bǔ)充了通過(guò)其他手段（如電子自旋共振）獲得的信息，并與之前的研究一起呈現(xiàn)了一幅有趣的圖片，在我們的實(shí)驗(yàn)溫度下，脂質(zhì)尾部順序和鏈流動(dòng)性是解耦的。

總的來(lái)說(shuō)，我們的結(jié)果在很大程度上證實(shí)了之前許多X射線和中子研究的預(yù)期，并提供了關(guān)于界面水在DNA/脂質(zhì)相互作用中的作用的額外信息，這些工具無(wú)法實(shí)現(xiàn)。更一般地說(shuō)，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了在DNA/脂質(zhì)相互作用的研究中，VSF光譜補(bǔ)充了更常用的結(jié)構(gòu)探針的方式。我們相信，這里給出的結(jié)果只是初步了解了VSF光譜在這一重要系統(tǒng)中可能的應(yīng)用。例如，未來(lái)VSF光譜學(xué)在DNA/脂質(zhì)系統(tǒng)中的應(yīng)用應(yīng)該能夠?yàn)槟承╆?yáng)離子脂質(zhì)單分子膜上發(fā)生的DNA雙鏈體分裂提供明確證據(jù)（目前根據(jù)X射線實(shí)驗(yàn)93中測(cè)量的吸附DNA厚度推斷）。此外，在更復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)中，人們可能會(huì)想象，正如我們中的一些人最近為更簡(jiǎn)單的系統(tǒng)所證明的那樣，94在存在和不存在DNA的情況下，探測(cè)界面水和脂質(zhì)官能團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移，以進(jìn)一步了解在這些條件下水域局部環(huán)境如何變化。

致謝

這項(xiàng)工作是“粘著voor Fundamenteel Onderzoek der Materiale（FOM）”研究項(xiàng)目的一部分，該項(xiàng)目由“荷蘭voor Wetenschapelijk Onderzoek（NWO）組織”資助?，旣悺ぞ永铮∕arie Curie）即將獲得的國(guó)際獎(jiǎng)學(xué)金（R.K.C.）提供了進(jìn)一步的資助。

可用支持信息：完整參考文獻(xiàn)3。該材料可通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)http://pubs免費(fèi)獲取。acs。組織。